RESUMEN: Para la identificación de levaduras se requiere realizar una serie de pruebas, de manera que se evidencie las características distintivas de la especie de levadura. La prueba del tubo germinativo o filamentacciòn se usa para observar el desarrollo o formación de hifas, blastoconidias, clamidosesporas y artrosporas y constituye una característica morfológica de gran importancia para la identificación de algunas especies de levaduras. La presencia de pseudohifas y blastoconidias, fue útil para identificar si la levadura pertenece a alguna especie del género Candida. El cultivo de levaduras en agar harina de maíz favorece la formación de pseudohifas y blastoconidios, de modo que puede hacerse la identificación presuntiva de especies de Candida. Las especies de Candida sp, dan negativa la prueba de la urea. Otra prueba útil fue la prueba de Asimilación de carbohidratos, los patrones de asimilación de azúcares (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa, dextrosa y rafinosa) permiten identificar las diferentes especies de Candida spp. Mediante el análisis de los resultados de las pruebas realizadas se logró la identificación presuntiva de la levadura Candida parapsilosis.
INTRODUCCIÓN
Las levaduras forman colonias de organismos unicelulares. Algunas especies de levaduras forman yemas que no logran separarse y dan lugar a una corta cadena de células llamada “Pseudohifa”. Se requiere una combinación de pruebas bioquímicas y morfológicas para identificar las levaduras. En las características morfológicas debe incluirse el color de las colonias, la medida y la forma de las células, la presencia de cápsula, la producción de hifas o pseudohifas, y la producción de clamidiosporas. Las pruebas bioquímicas incluyen la asimilación y fermentación de azúcares, prueva de la urea y la asimilación de nitrato.
El cultivo de levaduras en agar harina de maíz favorece la formación de pseudohifas y blastoconidios, de modo que puede hacerse en la identificación presuntiva de especies de Candida. En la prueba de Asimilación de carbohidratos los patrones de asimilación de azúcares (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa, dextrosa y rafinosa) permiten identificar las diferentes especies de Candida spp. Interpretación: Positivo: viraje del color del medio de cultivo hacia el amarillo. Negativo: no se produce viraje de color, permaneciendo el color del medio de cultivo.
La Producción de ureasa se basa en la capacidad de producir la enzima ureasa, la cual desdobla la urea en dióxido de carbono y amonio, incrementando el pH del medio y produciendo un cambio de color rojo púrpura en el indicador. Las especies de Candida sp, dan negativa la prueba de la urea.
Candida parapsilosis
Macroscópicamente cuando se cultiva en agar dextrosa Sabouraud, las colonias de C. parapsilosis son de color blanco, cremoso, brillante y lisa o arrugada. Microscópicamente la célula tiene forma aracniforme, aspecto de un arbusto. C. parapsilosis no forma hifas verdaderas y existe ya sea en una fase de la levadura o una forma pseudohifa. Las pseudohifa se han observado en agar harina de maíz.
El objetivo de la presente práctica de laboratorio es identificar una levadura problema, mediante las siguientes pruebas: Filamentación de levaduras, morfología en agar harina de maíz, prueba de asimilación de carbohidratos y prueba de la ureasa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Filamentación de levaduras.
En un tubo de 12 x 75 mm se colocaron 0.5 mL de suero humano y en el mismo se inoculo ligeramente de la colonia de levaduras (92). Se incubo el tubo a 37 ºC por 2-3 horas. Trascurridas las tres horas, se colocó una gota de la suspensión en un portaobjeto y se cubrió con un cubreobjetos, para finalmente observarse al microscopio con un objetivo seco.
Morfología de las levaduras en agar harina de maíz.
En una placa con agar harina de maíz se inoculo por estría la levadura del tubo marcado como (92). Sobre la mitad de la estría se colocó un cubreobjetos, esterilizado por explosión a la llama del mechero. Se incubo la placa por tres días a temperatura ambiente. Para observar el crecimiento de la colonia, se destapo la placa y se colocó sobre platina del microscopio, se observó colocando el lente sobre el cubreobjetos a 40x.
Prueba de asimilación de carbohidratos.
En esta prueba se evaluó la asimilación de los siguientes carbohidratos: dextrosa, galactosa, maltosa, sacarosa, lactosa, rafinosa y dextrosa-control negativo.
Se preparo una suspensión de la levadura (92), inoculando en un tubo 15 x150 mm con 9 mL de agua destilada estéril (aproximadamente un punto en la escala de MaFarland). A cada tubo de los carbohidratos se le agregó dos gotas de la suspensión de la levadura, se incubo por tres días a temperatura ambiente. Se uso el carbohidrato dextrosa como control negativo el cual no fue inoculado con la suspensión de la levadura.
Prueba de la ureasa
Se inoculo en un medio sólido de agar urea, por estría la levadura (92) e incubo por tres días a temperatura ambiente.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Característica de la levadura del tubo (92). Levadura de color blanco de aspecto cremoso, crecimiento de la colonia en todo el tubo.
Asimilación de carbohidratos: Se observó el cambio de color de verde claro (sin inocular) a amarillo (positivo a la asimilación del carbohidrato respectivo. En la tabla 1 se muestran los resultados.
Carbohidrato | Resultado |
Galactosa | (+) |
Maltosa | (+) |
Sacarosa | (+) |
Lactosa | (-) |
Rafinosa | (-) |
Dextrosa | (+) |
Dextrosa (-) | (-) |
Prueba de la urea: No se observó cambio en el color del medio, por lo que se tomó como una prueba negativa
Urea | (-) |
Filamentaciòn de levaduras: se observó la presencia de pseudohifas
Pseudohifas, blastoconidias, | (+) |
Filamentación | (-) |
Morfología de las levaduras en agar harina de maíz.
Características macroscópicas: Colonias blancas, redondas de contorno irregular, de tamaño pequeño.
Características microscópicas: Colonias aracniformes de aspecto arbolecerte.
DISCUSIONES
Mediante el análisis de los resultados de las pruebas relazadas (pruebas filamentaciòn de levaduras, morfología en agar harina de maíz, prueba de asimilación de carbohidratos y prueba de la ureasa) se logró la identificación presuntiva de la levadura Candida parapsilosis.
REFERENCIAS
Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2006). Microbiologia medica. Madrid: Elsevier Mosby.
Forbes, B. A., Bailey, W. R., Scott, E. G., Sahm, D. F., Weissfeld, A. S., & Trevino, E. A. (2009). Bailey & Scott diagnóstico microbiológico. Buenos Aires: Panamericana.
Vilata, C. J. J. (2006). Micosis cutáneas. Madrid [etc.: Editorial Médica Panamericana.
Ash, L. R., & Orihel, T. C. (2010). Atlas de parasitología humana. Buenos Aires: Médica Panamericana