RESUMEN
El aislamiento, purificación y demás manejos de moléculas de DNA y/o RNA es fundamental para el estudio y experimentación en biología molecular. Para lo cual se dispone de diferentes metodologías conformadas por distintos elementos, según el origen del DNA y finalidad del estudio. La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos El objetivo de esta práctica fue aislar, analizar y/o visualizar DNA bacteriano a parir de un cultivo aislado de S. eureu. El desarrollo de la metodología y técnica para el aislamiento y análisis- visualización del DNA, no se desarrollo con la adecuada destreza, por lo que no se pudo cumplir el objetivo de la práctica, y no se visualizó ninguna banda para la confirmación de la presencia de ADN.
El aislamiento, purificación y demás manejos de moléculas de DNA y/o RNA es fundamental para el estudio y experimentación en biología molecular. Para lo cual se dispone de diferentes metodologías conformadas por distintos elementos, según el origen del DNA y finalidad del estudio. La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos El objetivo de esta práctica fue aislar, analizar y/o visualizar DNA bacteriano a parir de un cultivo aislado de S. eureu. El desarrollo de la metodología y técnica para el aislamiento y análisis- visualización del DNA, no se desarrollo con la adecuada destreza, por lo que no se pudo cumplir el objetivo de la práctica, y no se visualizó ninguna banda para la confirmación de la presencia de ADN.
INTRODUCCIÓN
El material genético de las bacterias se encuentra en el citoplasma, se le denomina como nucleoide. Está compuesto de alrededor de 80% de DNA, 10% de RNA y 10% de proteínas (RNA polimerasa). El cromosoma bacteriano único contiene dos tiras complementarias de DNA que están enrolladas alrededor una de la otra en patrón helicoidal, con los extremos unidos para formar una molécula circular. La extracción de DNA a partir de suspensiones bacterianas ofrece menos consideración desde el manejo de la célula, así como la homogeneidad y riqueza que presenta el material. La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos celulares. La degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. Un método clásico de purificación de ácidos nucleicos se basa en el uso de disolventes orgánicos tóxicos, siendo la extracción mediante fenol/cloroformo la más conocida, con ello se consigue el objetivo de desproteinizar la muestra. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. La precipitación del ADN se logra por que el DNA es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fríoy recuperar mediante una centrifugación. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción. El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso de fluoróforos específicos. Para cuantificar el DNA se prepara una solución del DNA lisado, se realizan lecturas de absorbancia una a 260 nm especifica para DNA y otra a 280 nm para determinar la pureza del acido nucleico.
El material genético de las bacterias se encuentra en el citoplasma, se le denomina como nucleoide. Está compuesto de alrededor de 80% de DNA, 10% de RNA y 10% de proteínas (RNA polimerasa). El cromosoma bacteriano único contiene dos tiras complementarias de DNA que están enrolladas alrededor una de la otra en patrón helicoidal, con los extremos unidos para formar una molécula circular. La extracción de DNA a partir de suspensiones bacterianas ofrece menos consideración desde el manejo de la célula, así como la homogeneidad y riqueza que presenta el material. La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos celulares. La degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. Un método clásico de purificación de ácidos nucleicos se basa en el uso de disolventes orgánicos tóxicos, siendo la extracción mediante fenol/cloroformo la más conocida, con ello se consigue el objetivo de desproteinizar la muestra. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. La precipitación del ADN se logra por que el DNA es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fríoy recuperar mediante una centrifugación. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción. El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso de fluoróforos específicos. Para cuantificar el DNA se prepara una solución del DNA lisado, se realizan lecturas de absorbancia una a 260 nm especifica para DNA y otra a 280 nm para determinar la pureza del acido nucleico.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales: Centrifuga programada 2132con control de la temperatura, Rotor VWR minivoltexer rotator, lámpara ultravioleta, micropipeta de volumen variable, puntas para micropipetas amarillas y azules, encubadora y dos eppendorf.
Sustancias: EDTA 50Mm pH 8, PBS frío, PAS frío, acetato de amonio, fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. Enzimas de restricción para DNA y RNA y bromuro de etidio.
Método
Aislamiento y purificación de DNA. A partir de 3mL de un cultivo aislado de S. eureus, proporcionada en el laboratorio se realizó la purificación de DNA , se analizó el DNA mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Se tomaron 3 mL del cultivo y se centrífugo a 14,000 rpm por 10 minutos. Una vez que realizada la centrifugación se decanto. Se agrego 500µL de EDTA, se paso por un mininito por el rotor a fin de homogenizar la muestra antes de volver a centrifugar, se decantado nuevamente. Se agregó 50μL de PAS frío por, se colocó el eppendorf en el trotor por 40 segundos y se centrífugo por 15 minutos. Se decanto y se agregó 200 μL de enzimas proteasas a fin de favorecer la lisis y se encubó por 30 minutos a 50 ºC. Trascurrido los 30 minutos se agregó 400 μL (en realidad 40 μL por error en la micropipeta) una mezcla de solventes: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (24:24:1) en la campana de extracción. Se mezcló por inversión, se centrífugo por 3 minutos y se observó tres capas correspondientes a DNA y RNA (superficie), una capa blanca de lípidos (capa intermedia) y componentes proteicos, respectivamente. Como la capa superficial corresponde a DNA y RNA fue posible separarlos de las demás capas trasladándolos a otro eppendorf y posteriormente la precipitación de DNA, agregando un 40 μL de acetato de amonio y 800 μL de etanol 1/10, manteniendo lo anterior por 30 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló por inversión y se centrífugo a 14,000 rpm. Se decanto y el DNA fue resuspendido con 60 μL de una solución de (tris/ EDTA pH 8) para su posterior análisis electroforético.
Visualización del DNA en gel de agarosa. Se tomó 10μL de la muestra de DNA purificado tratado con enzimas de de restricción y se homogenizo con 10μL bromuro de etidio, del anterior homogenizado se tomaron 10μL que fueron dispuestos en un posillo en cubeta para electroforesis, se corrió la electroforesis con un voltaje de 80V. Se esperó algunos minutos para que el DNA corriera dentro del gel de acuerdo su diferencia de carga. Se detuvo la corriente eléctrica y se colocó una lámpara de de luz UV sobre la cubeta de electroforesis para visualizar bandas de DNA como consecuencia de la interacción de las bases de DNA y el bromuro de etidio el cual presenta la condición de ser fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. La cubeta de electroforesis fue proporcionada en el laboratorio con todos los elementos necesarios.
Materiales: Centrifuga programada 2132con control de la temperatura, Rotor VWR minivoltexer rotator, lámpara ultravioleta, micropipeta de volumen variable, puntas para micropipetas amarillas y azules, encubadora y dos eppendorf.
Sustancias: EDTA 50Mm pH 8, PBS frío, PAS frío, acetato de amonio, fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. Enzimas de restricción para DNA y RNA y bromuro de etidio.
Método
Aislamiento y purificación de DNA. A partir de 3mL de un cultivo aislado de S. eureus, proporcionada en el laboratorio se realizó la purificación de DNA , se analizó el DNA mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Se tomaron 3 mL del cultivo y se centrífugo a 14,000 rpm por 10 minutos. Una vez que realizada la centrifugación se decanto. Se agrego 500µL de EDTA, se paso por un mininito por el rotor a fin de homogenizar la muestra antes de volver a centrifugar, se decantado nuevamente. Se agregó 50μL de PAS frío por, se colocó el eppendorf en el trotor por 40 segundos y se centrífugo por 15 minutos. Se decanto y se agregó 200 μL de enzimas proteasas a fin de favorecer la lisis y se encubó por 30 minutos a 50 ºC. Trascurrido los 30 minutos se agregó 400 μL (en realidad 40 μL por error en la micropipeta) una mezcla de solventes: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (24:24:1) en la campana de extracción. Se mezcló por inversión, se centrífugo por 3 minutos y se observó tres capas correspondientes a DNA y RNA (superficie), una capa blanca de lípidos (capa intermedia) y componentes proteicos, respectivamente. Como la capa superficial corresponde a DNA y RNA fue posible separarlos de las demás capas trasladándolos a otro eppendorf y posteriormente la precipitación de DNA, agregando un 40 μL de acetato de amonio y 800 μL de etanol 1/10, manteniendo lo anterior por 30 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló por inversión y se centrífugo a 14,000 rpm. Se decanto y el DNA fue resuspendido con 60 μL de una solución de (tris/ EDTA pH 8) para su posterior análisis electroforético.
Visualización del DNA en gel de agarosa. Se tomó 10μL de la muestra de DNA purificado tratado con enzimas de de restricción y se homogenizo con 10μL bromuro de etidio, del anterior homogenizado se tomaron 10μL que fueron dispuestos en un posillo en cubeta para electroforesis, se corrió la electroforesis con un voltaje de 80V. Se esperó algunos minutos para que el DNA corriera dentro del gel de acuerdo su diferencia de carga. Se detuvo la corriente eléctrica y se colocó una lámpara de de luz UV sobre la cubeta de electroforesis para visualizar bandas de DNA como consecuencia de la interacción de las bases de DNA y el bromuro de etidio el cual presenta la condición de ser fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. La cubeta de electroforesis fue proporcionada en el laboratorio con todos los elementos necesarios.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Aislamiento y purificación de DNA Por error en la disposición en el volumen de la micropipeta se agregó 40 μL de una mezcla de solventes: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, en lugar de 400 μL dictados por la técnica, los cuales tienen la acción de separar o precipitar el DNA y RNA de los demás componentes celulares como lípidos y proteínas. Al resuspender el DNA en una solución de (tris/ EDTA pH 8) se observó algo similar a la imagen siguiente, más sin embargo, puede corresponder a otos componentes por lo que no se puede decir que corresponde explícitamente al DNA purificado.
Aislamiento y purificación de DNA Por error en la disposición en el volumen de la micropipeta se agregó 40 μL de una mezcla de solventes: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, en lugar de 400 μL dictados por la técnica, los cuales tienen la acción de separar o precipitar el DNA y RNA de los demás componentes celulares como lípidos y proteínas. Al resuspender el DNA en una solución de (tris/ EDTA pH 8) se observó algo similar a la imagen siguiente, más sin embargo, puede corresponder a otos componentes por lo que no se puede decir que corresponde explícitamente al DNA purificado.
Visualización y /o confirmación del aislamiento del DNA. Al momento de colocar el DNA con el colorante en el posillo de la cubeta de electroforesis, se regiría de destreza y pulso para que el DNA quedará contenido exactamente dentro del posillo, lo cual no se tuvo la certeza de lograrlo, ya que no se tenía habilidad ni experiencia previa. Al correr la electroforesis y observar con la lámpara de luz ultravioleta no se visualizó ninguna banda, más sin amargo se observó bandas correspondientes a otros equipos que correspondían a DNA.
DISCUSIONES
Considerando que todos los reactivos requeridos fueron proporcionados en condiciones adecuadas los errores se cometieron en la toma de los volúmenes y/o se contaminaron las muestras por falta de precaución en su manejo, la incorrecta homogenización del DNA con el bromuro de etidio y la interacción de los mismos, pudo determina que no se visualizarán bandas. La correcta disposición del DNA en el pocillo de la cubeta de electroforesis fue complicada por la falta de experiencia. Las anteriores condiciones son determinantes para no lograr aislar, purificar y visualizar DNA, como correspondió en este caso.
CONCLUSIONES
Se aprendió experimentalmente como aislar, analizar y/o visualizar DNA bacteriano a parir de un cultivo aislado de S. eureu y se corrió DNA purificado por electroforesis en gel de agarosa. El desarrollo de la metodología y/o técnica para el aislamiento y análisis- visualización del DNA, no se desarrollo con la adecuada destreza, por lo que no se pudo cumplir el objetivo de la práctica, y no se visualizó ninguna banda para la confirmación de la presencia de ADN. Para logar aislar, purificar y visualizar DNA es imprescindible seguir adecuadamente la técnica, la disposición exacta de los volúmenes y la nula contaminación de la muestra en cuestión.
BIBLIOGRAFÍA
Biología molecular de la célula. Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2001, cuarta edición