17 marzo, 2013

HEMATOLOGIA



CITOLOGIA HEMATICA

HEMOGLOBINA

Ceneval de Quimica Clínica


A) INVESTIGACION



B) NORMATIVILIDAD




C) DIAGNOSTICO POR EL LABORATORIO



D) VALIDACION E INTERPRETACION
 

 

05 diciembre, 2011

13 mayo, 2011

Identificación de levaduras


RESUMEN: Para la identificación de levaduras se requiere realizar una serie de pruebas, de manera que se evidencie las características distintivas de la especie de levadura. La prueba del tubo germinativo o filamentacciòn se usa para observar el desarrollo o formación de hifas, blastoconidias, clamidosesporas y  artrosporas y constituye una característica morfológica de gran importancia para la identificación de algunas especies de levaduras. La presencia de pseudohifas y blastoconidias, fue útil para identificar  si la  levadura pertenece a alguna especie del género Candida. El cultivo de levaduras en agar harina de maíz favorece la formación de pseudohifas y blastoconidios, de modo que puede hacerse la identificación presuntiva de especies de Candida. Las especies de Candida sp, dan negativa la prueba de la urea. Otra prueba útil  fue la prueba de Asimilación de carbohidratos, los patrones de asimilación de azúcares (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa, dextrosa y rafinosa) permiten identificar las diferentes especies de Candida spp. Mediante el análisis de los resultados de las pruebas realizadas se logró la identificación presuntiva de la levadura Candida parapsilosis.   


INTRODUCCIÓN

      Las levaduras forman colonias de organismos unicelulares. Algunas especies de levaduras forman yemas que no logran separarse y dan lugar a una corta cadena de células llamada “Pseudohifa”. Se requiere una combinación de pruebas bioquímicas y morfológicas para identificar las levaduras. En las características morfológicas debe incluirse el color de las colonias, la medida y la forma de las células, la presencia de cápsula, la producción de hifas o pseudohifas, y la producción de clamidiosporas. Las pruebas bioquímicas incluyen la asimilación y fermentación de azúcares, prueva de la urea y la asimilación de nitrato.

   El cultivo de levaduras en agar harina de maíz favorece la formación de pseudohifas y blastoconidios, de modo que puede hacerse en la identificación presuntiva de especies de Candida.  En la prueba de Asimilación de carbohidratos los patrones de asimilación de azúcares (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa, dextrosa y rafinosa) permiten identificar las diferentes especies de Candida spp. Interpretación: Positivo: viraje del color del medio de cultivo hacia el amarillo. Negativo: no se produce viraje de color, permaneciendo el color del medio de cultivo.

   La Producción de ureasa se basa en la capacidad de producir la enzima ureasa, la cual desdobla la urea en dióxido de carbono y amonio, incrementando el pH del medio y produciendo un cambio de color rojo púrpura en el indicador. Las especies de Candida sp, dan negativa la prueba de la urea.

Candida parapsilosis

     Macroscópicamente cuando se cultiva en agar dextrosa Sabouraud, las colonias de C. parapsilosis son de color blanco, cremoso, brillante y lisa o arrugada. Microscópicamente la célula tiene forma  aracniforme, aspecto de un arbusto. C. parapsilosis no forma hifas verdaderas y existe ya sea en una fase de la levadura o una forma pseudohifa. Las pseudohifa  se han observado en agar harina de maíz.

    El objetivo de la presente práctica de laboratorio es identificar una levadura problema, mediante las siguientes pruebas: Filamentación de levaduras, morfología en agar harina de maíz, prueba de asimilación de carbohidratos y prueba de la ureasa.  
 

MATERIALES Y MÉTODOS

      Filamentación de levaduras.

En un tubo de 12 x 75 mm se colocaron 0.5 mL de suero humano y en el mismo se inoculo ligeramente de la colonia de levaduras (92). Se incubo el tubo a 37 ºC por 2-3 horas. Trascurridas las tres horas, se colocó una gota de la suspensión en un portaobjeto y se cubrió con un cubreobjetos, para finalmente observarse al microscopio con un objetivo seco.

     Morfología de las levaduras en agar harina de maíz.

En una placa  con agar harina de maíz se inoculo por estría la levadura del tubo marcado como (92). Sobre la mitad de la estría se colocó un cubreobjetos, esterilizado por explosión a la llama del mechero. Se incubo la placa por tres días a temperatura ambiente. Para observar el crecimiento de la colonia, se destapo la placa y se colocó sobre platina del microscopio,  se observó colocando el lente sobre el cubreobjetos a 40x. 

   Prueba de asimilación de carbohidratos.

En esta prueba se evaluó la asimilación de los siguientes carbohidratos: dextrosa, galactosa, maltosa, sacarosa, lactosa, rafinosa y dextrosa-control negativo. 

Se preparo una suspensión de la levadura (92), inoculando en un tubo 15 x150 mm con 9 mL de agua destilada estéril (aproximadamente un punto en la escala de MaFarland). A cada tubo de los carbohidratos  se le agregó dos gotas de la suspensión de la levadura, se incubo por  tres días a temperatura ambiente. Se uso el carbohidrato dextrosa como control negativo el cual no fue inoculado con la suspensión de la levadura. 
 
Prueba de la ureasa

Se inoculo en un medio sólido de agar urea, por estría la levadura (92) e incubo por tres días a temperatura ambiente.  
 

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

  Característica de la levadura del tubo (92). Levadura de color blanco de aspecto cremoso, crecimiento de la colonia en todo el tubo.

  Asimilación de carbohidratos: Se observó el cambio de color de verde claro (sin inocular)  a amarillo (positivo a la asimilación del carbohidrato respectivo. En la tabla 1 se muestran los resultados.

 
Carbohidrato

Resultado


Galactosa

(+)
Maltosa
(+)
Sacarosa
(+)
Lactosa
(-)
Rafinosa
(-)
Dextrosa
(+)
Dextrosa (-)
(-)
    Tabla 1. Asimilación de carbohidratos. Dextrosa (-): control negativo, Resultado pasivito (+) y Resultado negativo (-).
   Prueba de la urea: No se observó cambio en el color del medio, por lo que se tomó como una prueba negativa
   
Urea
(-)
  Filamentaciòn de levaduras: se observó la presencia de pseudohifas
 
Pseudohifas, blastoconidias,
(+)
Filamentación
(-)
  Morfología de las levaduras en agar harina de maíz.
  Características macroscópicas: Colonias blancas, redondas de contorno irregular, de tamaño pequeño.
Figura 1. Agar harina de maiz. Observacion macroscópica de la colonia
  Características microscópicas: Colonias aracniformes de aspecto arbolecerte.
                    
DISCUSIONES

      Los resultados de las pruebas realizadas hacen suponer que la levadura es Candida parapsilosis. La característica microscópica que más favoreció esta suposición es la observación de las células de forma aracniforme, además de los resultados observados en la prueba de asimilación de carbohidratos y la observación de pseudohifas en la prueba del tubo germinativo. Estos resultados son comparables positivamente con los datos bibliográficos o de referencia asociados con la levadura Candida parapsilosis. Por lo que se realizó la identificación presuntiva de Candida parapsilosis.

CONCLUSIONES
 
 
    Mediante el análisis de los resultados de las pruebas relazadas (pruebas filamentaciòn de levaduras, morfología en agar harina de maíz, prueba de asimilación de carbohidratos  y prueba de la ureasa) se logró la identificación presuntiva de la levadura Candida parapsilosis.  

REFERENCIAS
Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2006). Microbiologia medica. Madrid: Elsevier Mosby.
Forbes, B. A., Bailey, W. R., Scott, E. G., Sahm, D. F., Weissfeld, A. S., & Trevino, E. A. (2009). Bailey & Scott diagnóstico microbiológico. Buenos Aires: Panamericana.
Vilata, C. J. J. (2006). Micosis cutáneas. Madrid [etc.: Editorial Médica Panamericana.
Ash, L. R., & Orihel, T. C. (2010). Atlas de parasitología humana. Buenos Aires: Médica Panamericana





10 diciembre, 2009

Aislamiento y análisis de DNA.

RESUMEN

El aislamiento, purificación y demás manejos de moléculas de DNA y/o RNA es fundamental para el estudio y experimentación en biología molecular. Para lo cual se dispone de diferentes metodologías conformadas por distintos elementos, según el origen del DNA y finalidad del estudio. La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos El objetivo de esta práctica fue aislar, analizar y/o visualizar DNA bacteriano a parir de un cultivo aislado de S. eureu. El desarrollo de la metodología y técnica para el aislamiento y análisis- visualización del DNA, no se desarrollo con la adecuada destreza, por lo que no se pudo cumplir el objetivo de la práctica, y no se visualizó ninguna banda para la confirmación de la presencia de ADN.
INTRODUCCIÓN

El material genético de las bacterias se encuentra en el citoplasma, se le denomina como nucleoide. Está compuesto de alrededor de 80% de DNA, 10% de RNA y 10% de proteínas (RNA polimerasa). El cromosoma bacteriano único contiene dos tiras complementarias de DNA que están enrolladas alrededor una de la otra en patrón helicoidal, con los extremos unidos para formar una molécula circular. La extracción de DNA a partir de suspensiones bacterianas ofrece menos consideración desde el manejo de la célula, así como la homogeneidad y riqueza que presenta el material. La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos celulares. La degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. Un método clásico de purificación de ácidos nucleicos se basa en el uso de disolventes orgánicos tóxicos, siendo la extracción mediante fenol/cloroformo la más conocida, con ello se consigue el objetivo de desproteinizar la muestra. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. La precipitación del ADN se logra por que el DNA es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fríoy recuperar mediante una centrifugación. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción. El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso de fluoróforos específicos. Para cuantificar el DNA se prepara una solución del DNA lisado, se realizan lecturas de absorbancia una a 260 nm especifica para DNA y otra a 280 nm para determinar la pureza del acido nucleico.
MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales: Centrifuga programada 2132con control de la temperatura, Rotor VWR minivoltexer rotator, lámpara ultravioleta, micropipeta de volumen variable, puntas para micropipetas amarillas y azules, encubadora y dos eppendorf.
Sustancias: EDTA 50Mm pH 8, PBS frío, PAS frío, acetato de amonio, fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. Enzimas de restricción para DNA y RNA y bromuro de etidio.

Método

Aislamiento y purificación de DNA. A partir de 3mL de un cultivo aislado de S. eureus, proporcionada en el laboratorio se realizó la purificación de DNA , se analizó el DNA mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Se tomaron 3 mL del cultivo y se centrífugo a 14,000 rpm por 10 minutos. Una vez que realizada la centrifugación se decanto. Se agrego 500µL de EDTA, se paso por un mininito por el rotor a fin de homogenizar la muestra antes de volver a centrifugar, se decantado nuevamente. Se agregó 50μL de PAS frío por, se colocó el eppendorf en el trotor por 40 segundos y se centrífugo por 15 minutos. Se decanto y se agregó 200 μL de enzimas proteasas a fin de favorecer la lisis y se encubó por 30 minutos a 50 ºC. Trascurrido los 30 minutos se agregó 400 μL (en realidad 40 μL por error en la micropipeta) una mezcla de solventes: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (24:24:1) en la campana de extracción. Se mezcló por inversión, se centrífugo por 3 minutos y se observó tres capas correspondientes a DNA y RNA (superficie), una capa blanca de lípidos (capa intermedia) y componentes proteicos, respectivamente. Como la capa superficial corresponde a DNA y RNA fue posible separarlos de las demás capas trasladándolos a otro eppendorf y posteriormente la precipitación de DNA, agregando un 40 μL de acetato de amonio y 800 μL de etanol 1/10, manteniendo lo anterior por 30 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló por inversión y se centrífugo a 14,000 rpm. Se decanto y el DNA fue resuspendido con 60 μL de una solución de (tris/ EDTA pH 8) para su posterior análisis electroforético.

Visualización del DNA en gel de agarosa. Se tomó 10μL de la muestra de DNA purificado tratado con enzimas de de restricción y se homogenizo con 10μL bromuro de etidio, del anterior homogenizado se tomaron 10μL que fueron dispuestos en un posillo en cubeta para electroforesis, se corrió la electroforesis con un voltaje de 80V. Se esperó algunos minutos para que el DNA corriera dentro del gel de acuerdo su diferencia de carga. Se detuvo la corriente eléctrica y se colocó una lámpara de de luz UV sobre la cubeta de electroforesis para visualizar bandas de DNA como consecuencia de la interacción de las bases de DNA y el bromuro de etidio el cual presenta la condición de ser fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. La cubeta de electroforesis fue proporcionada en el laboratorio con todos los elementos necesarios.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Aislamiento y purificación de DNA Por error en la disposición en el volumen de la micropipeta se agregó 40 μL de una mezcla de solventes: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, en lugar de 400 μL dictados por la técnica, los cuales tienen la acción de separar o precipitar el DNA y RNA de los demás componentes celulares como lípidos y proteínas. Al resuspender el DNA en una solución de (tris/ EDTA pH 8) se observó algo similar a la imagen siguiente, más sin embargo, puede corresponder a otos componentes por lo que no se puede decir que corresponde explícitamente al DNA purificado.

Visualización y /o confirmación del aislamiento del DNA. Al momento de colocar el DNA con el colorante en el posillo de la cubeta de electroforesis, se regiría de destreza y pulso para que el DNA quedará contenido exactamente dentro del posillo, lo cual no se tuvo la certeza de lograrlo, ya que no se tenía habilidad ni experiencia previa. Al correr la electroforesis y observar con la lámpara de luz ultravioleta no se visualizó ninguna banda, más sin amargo se observó bandas correspondientes a otros equipos que correspondían a DNA.

DISCUSIONES

Considerando que todos los reactivos requeridos fueron proporcionados en condiciones adecuadas los errores se cometieron en la toma de los volúmenes y/o se contaminaron las muestras por falta de precaución en su manejo, la incorrecta homogenización del DNA con el bromuro de etidio y la interacción de los mismos, pudo determina que no se visualizarán bandas. La correcta disposición del DNA en el pocillo de la cubeta de electroforesis fue complicada por la falta de experiencia. Las anteriores condiciones son determinantes para no lograr aislar, purificar y visualizar DNA, como correspondió en este caso.

CONCLUSIONES

Se aprendió experimentalmente como aislar, analizar y/o visualizar DNA bacteriano a parir de un cultivo aislado de S. eureu y se corrió DNA purificado por electroforesis en gel de agarosa. El desarrollo de la metodología y/o técnica para el aislamiento y análisis- visualización del DNA, no se desarrollo con la adecuada destreza, por lo que no se pudo cumplir el objetivo de la práctica, y no se visualizó ninguna banda para la confirmación de la presencia de ADN. Para logar aislar, purificar y visualizar DNA es imprescindible seguir adecuadamente la técnica, la disposición exacta de los volúmenes y la nula contaminación de la muestra en cuestión.

BIBLIOGRAFÍA

Biología molecular de la célula. Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2001, cuarta edición