El microscopio óptico representa una herramienta muy recurrida en distintos laboratorios, como biología celular, microbiología, etc. Por que permite ampliar el tamaño de objetos a gran medida. Las partes de microscopio se pueden describir como: parte mecánica, parte óptica y sistema de iluminación. La resolución de un microscopio óptico está determinada por la longitud de onda de la luz visible. Al ser el microscopio un instrumento óptico delicado se requiere que su operador tenga conocimiento sobre cada una de las partes y funciones de las mismas. Domine técnicas para uso adecuado, así como, conocimientos sobre cuidados de limpieza de todas sus partes y lentes incluyendo los respectivos agentes de limpieza. En la sangre periférica se distinguen diferentes formas celulares (glóbulos blancos, glóbulos rojos monocitos, eosinófilos, etc.) que se fueron observando con mayor resolución, al aumentar los objetivos, hasta llagar al objetivo de inversión que representa la mayor resolución del microscopio óptico El objetivo de la presente sesión de laboratorio correspondió al correcto uso del microscopio óptico compuesto, mediante el conocimiento de sus partes, adecuado funcionamiento y cuidado en uso respectivamente, así como desarrollar habilidad en su utilización al observar muestras (Frotis de sangre periférica).
INTRODUCCIÓN
El microcopio es el elemento determinante en estudio de la microbiología, al ampliar imágenes en gran medida, imágenes que de otra manera no lograríamos distinguir o ni si quiera observar.
Descripción de las partes del Microscopio
Parte Mecánica
Pie base o soporte basal: Es una pieza maciza y pesada para asegurar la estabilidad del aparato y servir de soporte a sus demás partes. Platina: Pieza metálica redonda o cuadrada donde se colocan las preparaciones; tiene en el centro una abertura circular por la que pasan los rayos luminosos procedentes del sistema de iluminación. La preparación se sujeta a las platinas fijas, con dos palanquitas móviles. Tubo: En el esta instalado el sistema óptico, constituido por dos tubos. Revolver: Pieza circular y giratoria en la que se insertan los objetivos. Brazo o soporte vertical: Parte por la cual debe asirse el microscopio para llevarlo de un lugar a otro. Carro o escuadra, pinzas: Parte mecánica accionadle mediante dos tornillos que permiten movimientos laterales o longitudinales para colocar la preparación en posición de observación. Tornillo Macrométrico: Tornillo de paso largo y por el cual se ejecutan desplazamientos grandes amplios y perceptibles a simple vista. Tornillo Micrométrico: En contraposición al anterior su paso es pequeñísimo y sus desplazamientos imperceptibles, debe usarse con sumo cuidado.1
Parte Óptica
Objetivos: Son los elementos más importantes del microscopio, se coloca cerca del material u objeto que se va a ver, formados por la reunión de varias lentes para corregir las aberraciones. Deben tratarse con mucho cuidado cualquier golpe puede variar la posición de las lentes y averiarlas. Se atornillan en el revolver. Son de dos clases, a) En seco, son los más empleados, entre la lente frontal y el porta objetivos solo hay aire, pertenecen los objetivos 10x y 40x, b) se llaman así porque debe interponerse entre la lente frontal y le preparación un líquido como por ejemplo aceite de inmersión. El aceite permite que entre más luz en el objetivo. Oculares: Los forman dos lentes separados por un diafragma y van montados en la extremidad superior del tubo, esta ubicados cerca del ojo del observador y produce un aumento secundario de la imagen creada por el objetivo. La lente superior se llama lente ocular; la inferior lente de campo.1
Sistema de Iluminación
Se encuentra situado bajo la platina y tiene la misión de iluminar los objetivos por medio de la luz transmitida, consta de: Diafragma: Va montado bajo la platina y permite graduar la fuente luminosa; el más usado es el tipo iris accionadle mediante manecilla lateral. Condensador: Sistema de lentes cuya función es condensar el haz de rayos luminosos, al enfocar la luz sobre el objeto permite una iluminación más uniforme del campo microscópico.1
El límite máximo de resolución de un microscopio óptico está determinado por la longitud de onda de la luz visible, que abarca desde1, 4μm (para el violeta) hasta 0,7μm (para el rojo lejano). La distancia límite a la que dos objetos pueden verse por separado -conocida como límite de resolución – depende tanto de la longitud de onda de la luz como de la apertura numérica de las lentes del sistema utilizado. Este último valor es una medida de la profundidad del ocular del microscopio, escalada en función a su distancia del objeto; expresándolo gráficamente, cuando más abre su ojo el microscopio es mayor su agudeza visual. El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminación y la lente ocular.2
Manejo adecuado del microscopio
Al ser el microscopio un instrumento óptico delicado, su manejo o trasporte debe de ser cuidadoso (tomarse de la base y brazo). Cuando se pretenda moverlo será necesario levantarlo y no arrastrarlo sobre la superficie, para no dañar su sistema óptico.
Normalmente el microscopio estará protegido del polvo con una funda, la cual se deberá cuidar.
El microscopio previo y después de su uso deberá encontrarse en las siguientes condiciones: partes y lentes limpios, objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. Asegurarse de la limpieza las diferentes partes y lentes del microscopio o en su defecto limpiar, al encender la fuente de luz deberá encontrarse en su más baja intensidad. Una vez, de haberse cerciorado de las condiciones ideales de uso, conectar el microscopio a la fuente de electricidad y encender su luz. Ajustar la intensidad de luz y alinear los lentes. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. Comenzar la observación con el objetivo de 4x 1
Para realizar el enfoque: Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.1
Pasar al siguiente objetivo. Bajar un poco la platina para evitar que tope con los objetivos. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran percances: incrustarlo en la preparación.1
Empleo del objetivo de inmersión: Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar una gota de aceite inmersión. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión en sentido contrario para evitar ensuciar los otros objetivos o la platina. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el porta objetos. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y limpiar los lentes del los objetivos y objetos sobre la platina. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.1
Otras recomendaciones: Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de óptica. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica. En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 1
Aceite de inmersión
El aceite de inmersión se utiliza para el objetivo de 100x. Se usa generalmente aceite de cedro. Es un tipo especial de aguarrás, muy viscoso, que se obtiene del abeto Abies balsamea.
El índice de refracción del portaobjeto vidrio (1,5 aprox.), y del aceite de inversión son prácticamente iguales, los rayos de luz no son refractados al pasar de un medio a otro, lo que se traduce en una mayor resolución. El aceite de inmersión restringe el movimiento de la muestra, evita el rozamiento entre el cubre objeto y el objetivo de inmersión, y evita que la luz se desvíe propiciando que llegue concentrada hacia la muestra.1
Células de Frotis de sangre periférica
Procedimiento por el que se observa bajo un microscopio una muestra de sangre para contar los distintos tipos de células sanguíneas que circulan (glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas, etc.) y para determinar si el aspecto de las células es anormal.3
MATERIALES Y MÉTODOS
Se verifico las condiciones del microscopio óptico Leica pericromático (Nº 21) previo a su uso (fuente de luz a la menor intensidad, que la parte mecánica de la platina no sobresalga sobre el borde de la misma y que se encuentre abajo, limpieza de las partes y lentes (que fueron limpiadas), etc.). Las cuales resultaron adecuadas. Se conectó a la fuente eléctrica, encendió la fuente de luz y se régulo la intensidad de la misma. La muestra (frotis de sangre periférica) fue colocada sobre la platina sujetándola con las pinzas. Se ajustó el objetivo 10x acercando la lente objetivo a la preparación utilizando el tornillo macrométrico, mirando directamente y no a través del ocular, para no incrustar el objetivo en la preparación y así no dañar alguno de ellos o ambos. Mirando a través de los oculares, se ajustó lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observó más clara la muestra, se giró el micrométrico hasta obtener una imagen fina. Figura 3.
Una vez terminada la observación en el objetivo 10x, se ajustó para el objetivo 40x. Bajando un poco la platina para evitar que tope con los objetivos. Sólo se ajustó un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Como el objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación, cuidó de no incrustarlo en la, misma. Figura 4.
Para observar el frotis de sangre con el objetivo de inversión. Se bajó totalmente la platina, se colocó una pequeña gota de aceite de inmersión en el centro del de la muestra del portaobjeto, el revólver se giró en sentido contrario de manera que el aceite no ensuciará otros objetivos ni partes presentes o cerca de la platina. Mirando directamente al objetivo, se subió la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. Cuidando la distancia de la preparación y la lente, se enfoca y se observa la preparación. Figura 5.
Una vez finalizada la observación de la preparación se bajó la platina y se colocó el objetivo de menor aumento girando el revólver. Se retiró la preparación de la platina. Cuidando de no retirar el objetivo de inmersión en posición de observación. Se procedió a limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel y liquido especial para óptica. Se limpió el objetivo 40x y demás objetivos y lentes se encontraran perfectamente limpios. Se colocó el microscopio en la s siguientes condiciones: fuente de luz a la menor intensidad, que la parte mecánica de la platina no sobresalga sobre el borde de la misma y que se encuentre abajo, limpieza de las partes y lentes (que fueron limpiadas), etc. Cada integrante del equipo ajustó la distancia interpupilar a su medida. Alineación del condensador 17.5.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
REFERENCIAS
1) Manual de prácticas de microbiología. Carlos Ganazo, Ignacio López-Guñi, Ramón Díaz. Tercera edición. Editorial Masson. España 2005.
2) Biología molecular de la célula. Albert Bruce. Tercera edición. Ediciones Omega, reimpresión enero, 2002.
3) Wheather’s Functional Histology A Text And Colour Atlas. H.G.Burkitt, B. Young, J.W. Heath. Churchill Livingstone. 3rd edition. 1993.