En las clases de enzimas que catalizan la hidrólisis de diversos èsteres hay diferencia entre las lipasas y las Esterasas. Esta diferencia se basa en su especificidad preferencial y grasas, o sea triglicéridos de ácidos grasos, de cadena larga, mientras que los substratos naturales de las esterasas, son los esteres sencillos de ácidos de bajo peso molecular. Sin embargo las dos clases de enzimas son sumamente inespecíficas en cuanto a su acción, y la naturaleza del acido graso o del alcohol tiene efecto no en la especificidad sino en la velocidad de reacción.
La hidrólisis de los triglicéridos que consumen los animales superiores se lleva a cabo principalmente en el intestino delgado, por medio de enzimas lipolìticas elaboradas en el páncreas. Las lipasas pancreáticas existen en dos tipos: las especificas para romper la unión ester en la posición alfa o alfa prima de los triglicéridos, y las especificas para las uniones beta. La hidrólisis completa de los triglicéridos procede entonces por pasos. Primero se hidrolizan rápidamente las uniones alfa y alfa prima, luego lentamente se rompe las uniones beta.
Estas reacciones se aceleran con las sales biliares como taurocolato o glicocolato de sodio, que emulsifican y solubilizan a los lípidos. Las sales biliares vienen en la bilis, secreción del hígado que pasa al intestino se provoca por la hormona colecistocinina, que se sintetiza en el intestino delgado y se libera a la circulación en respuesta en presencia de lípidos en el duodeno.
La lipasa (EC.3.1.1.3) (triacil glicerol acil hidrogenasa). También llamada antiguamente esteapsina, extraída de diferentes fuentes biológicas, contiene siempre diversas fracciones proteicas de muy diversos pesos moleculares, que van desde 39,000 hasta 200,000, todas ellas con actividad lipolìca. Estas esterasas hidrólisis substratos emulsificado, y no ataca a substratos en verdadera solución. Se cree que esto se debe a que la enzima se absorbe a su substrato emulsificado, y a la velocidad inicial de reacción está en función del número de moléculas de enzima adsorbidas en la interfase. Se le llama Pancreatina a un extracto de páncreas con fuerte actividad lipolitica. El método titrimètrico para determinar la acción de la lipasa, consiste en estimar por titulación la cantidad de ácidos grasos liberados de los èsteres.
OBJETIVO
Observar la actividad de la enzima lipasa indirectamente por titulación de los ácidos grasos liberados utilizando como base al hidróxido de potasio.
MATERIALES Y MÉTODOS
Acción de la lipasa Pancreática sobre la leche homogenizada. A cinco tubos numerados del uno al cinco se agregaron 10 mL de leche homogenizada, a cada uno. Tres mL de pancreatina al 5% se agregaron a cada uno de los cinco tubos de ensaye anteriores. Inmediatamente después, se agito y se agrego el contenido del tubo uno a un vaso de precipitado de 250 mL que contenía previamente 25 mL de alcohol etílico de 95 grados. También se agitaron los tubos dos, tres, cuatro y cinco. Para después llevarlos a un baño de agua a 37º C, registrando la hora exacta. Se agito el contenido del primer vaso de precipitado, se añadió 0.5mL de fenolftaleina y titulado con KOH 0.05 N hasta un obtener color rosa permanente. A los 10 minutos se sacó el tubo 2, y vació su contenido a otro vaso de precipitado con 25 ml de alcohol etílico, se añadió 0.5 ml de de fenolftaleina y se tituló con KOH de la misma manera que el caso anterior. A los 20 minutos saque el tubo numero 3, a los 30 minutos el tubo número 4 ya los 40 minutos el tubo 5. De el mismo tratamiento del tubo 1. Para los cálculos reste el valor obtenido con el tubo 1, que es el testigo, de los valores obtenidos en los siguientes tubos. Calcule los ml de KOH consumidos en cada tubo, y grafique ml de KOH vs tiempo.
Materiales:
1 Bureta de 25 mL
1 Soporte y pinza mariposa
5 Tubos de ensaye de 15x150 (gradilla)
1Pipeta de 10 mL
1 Pipeta de 5 mL
5 Vaso de precipitado de 250 mL
1 Agitador
1 Termómetro de 100°C
Reactivos:
50 mL de leche homogenizada
15 mL de pancreatina al 1%
125 mL de alcohol etílico de 90°
2.5 mL de fenolftaleína
45.5 mL de hidróxido de potasio(KOH)
OBSERVACI
ONES Y RESULTADOS
Como los substratos de la lipasa son los triglicéridos de cadena larga a los cuales hidroliza, rompen la unión Ester en la posición alfa y por lo tanto hay más triglicéridos después del rompimiento para lo cual se necesita más mL de KOH, para que los ácidos reaccionen con la base en presencia del alcohol y el producto es glicerol y sales de potasio de los ácidos grasos. Que es proporcional a los ácidos liberados.
CONCLUSIONES
Los triglicéridos son compuestos insoluble en agua, al álcalis que se usa en esa hidrólisis debe prepararse en alcohol se usa hidróxido de potasio disuelto en alcohol, siendo el resultado la hidrólisis de las ácidos grasos, en su forma sal de potasio y el glicerol libre. La lipasa Cataliza la hidrólisis de los ácidos grasos, rompiendo su larga cadena.
Se Observó la actividad de la enzima lipasa indirectamente por titulación de los ácidos grasos liberados.
CUESTIONARIO
¿Cuál es la acción de la lipasa pancreática? ¿Cuál es la diferencia entre lipasa y esterasa?
Cataliza la hidrólisis de los ácidos grasos. La diferencia se basa en su especificidad preferencial selectiva, es decir el substrato de la lipasa son triglicéridos de ácidos grasos de cadena larga, mientras que para las esterasas son los esteres sencillos de ácidos de bajo peso molecular.
¿Para qué sirven las sales biliares en la hidrólisis de las grasas?
La función de las sales biliares es la de emulsificar a los lípidos para que puedan ser de las enzimas lipasas y los productos puedan absorber por las membranas de las células intestinales, son como poderosos detergentes, solubles en agua. La solubilidad en agua la confiere el carácter polar de las sales.
¿Por qué en nuestro experimento para demostrar la acción de la lipasa podemos usar leche homogenizada, y como se debería hacer el experimento si se usara leche no homogenizada?
Los triglicéridos son insolubles en agua, por lo que es necesario trabajar con emulsiones, leche homogenizada por ejemplo, puesto que la velocidad de la hidrolisis dependerá del estado de dispersión de la enzima, para lograr una interface agua lípido. Si la leche no se encuentra homogenizada difícilmente se podrá, la grasa estará muy entera para, por lo que se tendrá que emulcificar.
¿Por qué en la demostración de la acción de la lipasa, el KOH consumido en la titilación, aumenta en cantidad a medida que trascurre el tiempo de reacción?
Como los substratos de la lipasa son los triglicéridos de cadena larga a los cuales hidroliza, rompen la unión Ester en la posición alfa y por lo tanto hay más triglicéridos después del rompimiento para lo cual se necesita más mL de KOH, para que los ácidos reaccionen con la base en presencia del alcohol y el producto es glicerol y sales de potasio de los ácidos grasos. Que es proporcional a los ácidos liberados.
¿Cuál es la acción de la hormona colecistocinina en el proceso normal de digestión de las grasas? Las hormonas que controlan la digestión son la gastrina, la secretina y la colecistocinina. La colecistocinina hace que el páncreas crezca y produzca las enzimas del jugo pancreático, y hace que la vesícula biliar se vacíe.
INVESTIGACIÓN
¿Qué son las lipoproteínas y cuáles son sus funciones en el organismo?
Las lipoproteínas son complejos macromoleculares esféricos formados por un núcleo que contiene lípidos apolares (colesterol esterificado y triglicéridos) y una capa externa polar formada por fosfolípidos, colesterol libre y proteínas (apolipoproteínas). Las lipoproteínas son agregados moleculares esféricos con una cubierta de unos 20 Ā de grosor formada por lípidos anfotéricos cargados, como colesterol no esterificado y fosfatidilcolinas; entre ellos se insertan las apolipoproteínas. Estas moléculas dirigen sus regiones apolares hidrófobas hacia el interior y sus grupos cargados hacia el exterior, donde interaccionan con el agua. Las lipoproteínas se dividen en varios grupos según su densidad: HDL: Lipoproteínas de alta densidad. Estas se conocen como las protectoras. Ya que no permiten que las otras lipoproteínas que son las agresoras se peguen a las células y nos provoque daños en nuestro cuerpo. IDL: Lipoproteínas intermedias.LDL: Lipoproteínas de baja densidad. Estas son las agresoras y son las que más daño nos pueden producir porque contienen mayor cantidad de colesterol, estas cantidades de colesterol y ésteres asociadas a la LDL son habitualmente de unas dos terceras partes del colesterol plasmático total.
Su función principal es el transporte de triglicéridos, colesterol y otros lípidos entre los tejidos a través de la sangre. Los quilomicrones y las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) transportan por el cuerpo los triacilgliceroles provenientes de la comida y los endógenos (producidos por el organismo). Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las de alta densidad (HDL) transportan el colesterol proveniente de la comida y el endógeno. Las HDL y las lipoproteínas de muy alta densidad (VHDL) transportan los fosfolípidos ingeridos y los endógenos. Las proteínas que se utilizan en el transporte de los lípidos son sintetizadas en el hígado y son denominadas «apolipoproteínas» o «apo». Hasta 8 apolipoproteínas pueden estar involucradas en la formación de la estructura de una lipoproteína. Las proteínas son llamadas Apo A-1, Apo A-2, Apo B-48, Apo C-3, etc.En su conjunto, las lipoproteínas conservan una concentración de lípidos en sangre de unos 500 mg de lípidos totales en 100 ml de sangre. De estos 500, 120 mg son triacilgliceroles (TAG), 220 mg es colesterol y 160 mg es fosfolípido. Las LDL contienen, típicamente, el 50-70 % del colesterol total sérico y ambos están directamente relacionados con los riesgos de enfermedades cardíacas o coronarias. Las HDL contienen, normalmente, el 20-30 % del colesterol total; los niveles de HDL están inversamente relacionados con los riesgos de enfermedades cardíacas o coronarias. Las VLDL contienen 10-15 % del colesterol sérico total y la mayor parte de los triglicéridos en el suero post-ayuno; las VLDL son precursoras de las LDL; se presume que algunas formas de VLDL, en especial las VLDL residuales, son aterogénicas. Pequeñas cantidades de colesterol son transportadas, también, por dos clases menores de lipoproteínas: las lipoproteínas de densidad intermedia («Intermediate Density Lipoproteins» o IDL), de densidad 1,006-1,019 Kg. /L y las lipoproteínas(a) de densidad 1,045-1,080 Kg. /L. Los quilomicrones (densidad <1,006 href="http://www.monografias.com/trabajos/epistemologia2/epistemologia2.shtml">el conocimiento de la homiostasis del colesterol que puede comprenderse revisando las consecuencias que tienen las concentraciones plasmáticas elevadas de colesterol cuando se mantiene de forma prolongada. El colesterol es muy insoluble y se acumula en los leucocitos que se depositan en las zonas de lesión sobre las paredes internas de las arterias. Si las concentraciones de colesterol son demasiado altas para su posterior eliminación hacia el torrente sanguíneo, estas células quedan repletas de depósitos grasos, que luego se endurecen formando una placa, y finalmente obstruyen vasos sanguíneos causando infartos, o sea, ataques cardiacos. VLDL: Lipoproteínas de muy baja densidad y son precursoras de las lipoproteínas se baja densidad.
Tanto el colesterol como los triglicéridos son transportados en sangre formando parte de moléculas llamadas lipoproteínas. Estas lipoproteínas están constituidas además por fosfolípidos, colesterol, proteínas y apolipoproteínas (Figura 1). De acuerdo a la participación porcentual de los diferentes componentes estructurales, se las clasifica en quilomicrones (QM), lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de elevada densidad (HDL) y lipoproteínas de densidad intermedia (IDL).
BIBLIOGRAFÍA
Garcilaso Pérez, Jesús Rubén. Bioquímica metabólica, Hermosillo, Sonora, Editorial Unison. Imprenta Universitaria, 1983.
Garcilaso Pérez, Jesús Rubén, Eva Irma Véjar Rivera. Bioquímica descriptiva, 4a ed.-Hermosillo, Sonora Editorial UNISON, 2004
Eva Irma Véjar Rivera. Practicas de Bioquímica metabólica y enzimología, Hermosillo, Sonora, Editorial Universidad de Sonora, 1991