La peroxidasa es una homoproteína altamente específica para el aceptor de hidrogeno, que es el peroxido de hidrogeno, pero es muy inespecífica en cuanto al sustrato donador que utiliza, que puede ser una de muchas sustancias, por ejemplo: fenoles, aminofenoles diaminas, indofenoles, leucocolorantes, ascorbato e incluso ciertos aminoácidos como tirosina.
La reacción se puede seguir de la siguiente manera:
Donador reducido + H2O2 peroxidasa donador oxidado + 2H2O
Esta enzima se encuentra en la mayoría de las plantas y en ciertos microorganismos, pero es escasa en los tejidos animales. Se observa la actividad de la peroxidasa en la leche (lactoperoxidasa), en los leucocitos (leucoperoxidasa) o mieloperoxidasa), en la placenta una de las formas más activas en la peroxidasa del rábano.
El mecanismo de acción es sumamente parecido al que se propone para la catalasa, a través de la formación de un complejo. Más aun, en este caso son diversos los complejos los complejos que se forman entre la enzima y el peroxido de hidrogeno de que sea capaz de reaccionar con el donador reducido.
La polifenol oxidasa recibe muchos nombres debido a la gran diversidad de sustratos que emplea. Técnicamente es una o-difenol: oxigeno reductasa. Su reacción se puede describir de la siguiente manara:
2 o- difenol + O2 polifenol oxidasa 2O-quinona + 2 H2O
Esta enzima puede llevar a cabo la oxidación directa aerobia de compuestos mono y difenoles (tirosina, fenol, p-cresol, 3, a-dimetil fenol, 4-terbutilfenol). También puede atacar a o-difenoles y a la adrenalina. Es una enzima de peso molecular 120.00, con un centro de cobre.
La polifenol oxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos en orden de mayor a menor actividad: acido clorhídrico, catecol, quercitina, piragalol, acido cafeico, 3,4-dihidroxifenilalanina, p-creso, tirosina entre otros. Las quinonas resultantes de la reacción de la polifenol oxidasa pueden continuar oxidándose y polimerizándose, para dar compuestos finales que son muy complejos y coloridos.
Es difícil distinguir las actividades de las dos enzimas a partir de la misma fuente, ya que pueden atacar a los mismos substratos. De Sin embargo utilizando papa como fuente de las enzimas, la reacción de la peroxidasa es mucho mas rápida, cosa que puede permitir la observación de las dos acciones 1
OBJETIVO
Demostrar las dos actividades enzimáticas, peroxidasa y Polifenol oxidasa, a partir de un extracto de papa.
MATERIALES Y REACTIVOS
Material necesario.
1 Gradilla 1 Mortero
15 tubos de ensaye de 13 x 100 1 vaso de precipitado de 500 mL
2 vasos de precipitados de 250 ml 1 Agitador
Pipeta de 5 ml y 3 de 1 ml. 1 Mechero, tripie y tela de asbestos
1 Pinzas para tubo de ensaye 1 gasa
1 Pelador
Hielo
Reactivos
25 mL de Catecol al 1%
25 mL Pirogalol al 1%
4 mL Tirosina al 1%
35 mL Peroxido de hidrogeno al 3%
8 gotas Cianuro de sodio
10 mL de agua destilada.
10 mL Exacto de papa precalentado y frio 40 mL
PROCEDIMIENTO
“Lo indicado en este punto debe hacerse lo más rápido posible”
Una papa limpia se rallo, molió en un mortero. Al mortero le pusimos hielo y 100 ml agua destilada. Se dejo reposar por 10 min. Se filtro a un vaso de precipitados que estaba sumergido en el hielo, la pulpa que quedo en la gasa y se desecho. Dejamos reposar el filtrado por 5 minutos para que el almidón se asiente en el fondo, después volvimos a decantar y el nuevo filtrado lo colocamos en hielo. Este liquido filtrado le llamamos “Extracto de papa”. Obtuvimos más de 50 ml. Después en una gradilla colocamos 13 tubos y los enumeramos del 1 al 13. Se coloco 0.5 ml de catecol al 1 % a los 1, 2, 3, 4, 11.
Después colocamos 0.5 ml pirogalol al 1 % 5, 6, 7, 8, 12. Luego colocamos 2 ml de tirosina al 1 % a los tubos 9 y 10. Después le pusimos 0.5 ml de peróxido de hidrógeno al 3 % a los tubos 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12. Se agrego 4 gotas de cianuro de sodio al 5% a los tubos 7 y 8. Tomamos 5 ml del extracto de papa y los colocamos en dos tubos de ensaye sin número y los calentamos por 5 min. En baño de agua hirviendo. Después pipeteamos 5 ml de agua destilada a los tubos 11 y 12.
Pipeteamos 5 ml del extracto de papa a los tubos 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 13. Mezclamos bien dejamos reposar la temperatura ambiente y observamos los cambios de color a los 2, 5, 10 y 15 minutos.
Resultados
Tubo 1 0.5 mL Catecol al 1% 5.0 mL Extracto de papa
Polifenol oxidasa actuó libremente sobre el catecol
Tubo Nº2 0.5 mL Catecol al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 5.0 mL Extracto de papa
La peroxidasa actuó libremente sobre el catecol
Tubo Nº 3 0.5 mL Catecol al 1% 5.0 mL Extracto de papa precalentado
La Polifenol oxidasa se inactivo por el efecto de la temperatura
Tubo Nº4 0.5 mL Catecol al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 5.0 mL Extracto de papa precalentado
La peroxidasa se inactivo por el efecto de la temperatura
Tubo Nº 5 0.5 mL Pirogalol al 1% 5.0 mL Extracto de papa
Polifenol oxidasa actuó libremente sobre el catecol
Tubo Nº 6 0.5 mL Pirogalol al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 5.0 mL Extracto de papa
La peroxidasa actuó libremente sobre el pirogalol
Tubo Nº 7 0.5 mL Pirogalol al 1% 4 gotas Cianuro de sodio 5.0 mL Extracto de papa
Polifenol oxidasa se inhibió por la presencia del cianuro
Tubo Nº 8 0.5 mL Pirogalol al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 4 gotas Cianuro de sodio 5.0 mL Extracto de papa
La peroxidasa se inhibió por la presencia del cianuro
Tubo Nº 9 2.0 mL Tirosina al 1% 5.0 mL Extracto de papa
Polifenol oxidasa actuó libremente sobre la tirosina
Tubo Nº 10 2.0 mL Tirosina al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 5.0 mL Extracto de papa
La peroxidasa actuó libremente sobre la tirosina
Tubo Nº11 0.5 mL Catecol al 1%0.5 mL H2O2 al 3%5.0mL Agua destilada
No hay enzima, los compuestos se oxidan por el oxigeno atmosférico
Tubo Nº 12 0.5 mL Pirogalol al 1%0.5 mL H2O2 al 3%5.0 mL Agua destilada
No hay enzima, los compuestos se oxidan por el oxigeno atmosférico
Tubo Nº 13 5.0mL de agua destilada
No hay enzima, sirve como patrón de observación
Substratos de las enzimas peroxidasa y polifenol oxidasa
Catecol
Pirogalol
Tirosina
2-Estructuras
ü La peroxidasa actúa con mayor velocidad que el polifenol oxidasa.
ü Orden de preferencia del la peroxidasa por los substratos: catecol, pirogalol y tiamina, en base a la velocidad de reacción. Liberación de burbujas O2 e intensidad de color.
ü Orden de preferencia del polifenol oxidasa por los substratos catecol, pirogalol y tiamina, en base a la velocidad de reacción e intensidad de color que se fue atenuando del catecol a la tiamina.
ü El efecto de los inhibidores se observo claramente, puesto que fueron eficientes. No se observo que uno actuara mejor que otro aparentemente.
ü Las enzimas pueden tener substratos en común.
CONCLUSIÓN
Se demostró las dos actividades enzimáticas de la peroxidasa y polifenol oxidasa partir de de la misma fuente, el extracto de la papa, y la acción inhibidora de la temperatura y el CN- . En base a los resultados la peroxidasa es mucho más rápida en actuar que el Polifenol oxidasa.
2 minutos
5 minutos
10 minutos
15 minutos
Reacciones con más activadas (peroxidasa)
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son los productos de la reacción de la peroxidasa dado que el substrato fuera polifenol?
Polifenol? Donador reducido + H2O2 peroxidasa polifenol? donador oxidado + 2H2O
Al igual que el Pirogalol que es un polifenol
2.- ¿Qué diferencia hay entre las enzimas peroxidasa y polifenol oxidasa?
Que una actúa en presencia de peroxido de hidrógeno (aceptor de hidrógenos altamente especifico), la peroxidasa y la polifenol oxidasa en presencia de O2, además de tener un centro de cobre.
3.- Supuesto que las dos pueden venir en la misma fuente, ¿cómo podemos distinguirlas?
La acción de la peroxidasa es mucho más rápida, cosa que puede permitir la observación de las dos acciones.
4.- ¿Cuál es la razón de la diferencia de color con los diferentes substratos?
El anillo fenolico esta más sustituido del catecol a la tiamina, lo que dificulta la oxidación.
5.- ¿Para qué se añade peroxido de hidrogeno al vaso de reacción?
Según la reacción de la peroxidasa
Donador reducido + H2O2 peroxidasa donador oxidado + 2H2O
Para la reacción de redox
6.- ¿Qué efecto tiene en el hígado la acción conjunta de peroxidasa y catalasa, y que diferencia hay entre las dos enzimas?
La peroxidasa es escasa en tejidos animales, mientras que la catalasa esta concentrada en los glóbulos rojos y puede actuar sobre el pirogalol. La catalasa seria más eficaz.
7.- ¿Por qué las manipulaciones para la preparación del extracto de enzima se llevan a cabo a bajas temperaturas?
Para evitar el contacto con el oxigeno atmosférico haga que las enzimas comiencen a actuar sobre los sustratos normales.
8.- ¿Por qué al estar trabajando con una enzima hay que evitar la formación de espuma, y como puede evitarse?
La espuma es la liberación de oxigeno, en este caso quitando el peroxido de hidrogeno, pero la peroxidasa es altamente específica para el mismo aceptor de hidrógenos. Manteniendo la temperatura por de bajo de la de acción.
BIBLIOGRAFÍA
1.- Manual de laboratorio de bioquímica metabólica Gracilazo
Lecturas:
http://es.wikipedia.org/wiki/Peroxidasa
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte08/02.html
Estructuras:
2. http://www.artbiochem.com/recursos/akpcespanol.pdf